克隆動(dòng)物的研究在異種器官移植、抗病育種和乳腺生物反應(yīng)器等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，下面是由學(xué)習(xí)啦小編整理的動(dòng)物克隆技術(shù)論文，謝謝你的閱讀。

　　動(dòng)物克隆技術(shù)論文篇一

　　細(xì)胞水平分析克隆動(dòng)物異常發(fā)育的原因

　　摘要：克隆動(dòng)物的研究在異種器官移植、抗病育種和乳腺生物反應(yīng)器等方面具有廣泛的應(yīng)用前景， 但目前的克隆動(dòng)物的效率很低，只有不到10%的胚胎能發(fā)育到個(gè)體，而且這些個(gè)體中多有異常發(fā)育的現(xiàn)象。本文主要對(duì)導(dǎo)致克隆動(dòng)物異常發(fā)育的原因在細(xì)胞水平作了較為全面的分析。

　　關(guān)鍵詞：克隆 核移植 異常發(fā)育

　　中圖分類號(hào)：Q132 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336(2013)14-0036-03

　　1997年2月27日，英國《自然》雜志公布了一項(xiàng)愛丁堡羅斯林研究所威爾莫特等人的研究成果：經(jīng)歷了247次失敗之后，終于在1996年他們得到了一只克隆雌性小綿羊，取名“多利”。自從多利產(chǎn)生國內(nèi)外生物科學(xué)工作者在克隆動(dòng)物技術(shù)上取得了顯著的成績。在畜牧業(yè)中，克隆動(dòng)物具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、繁育優(yōu)良品種、改善畜產(chǎn)品質(zhì)量等優(yōu)勢(shì);在醫(yī)藥方面，克隆動(dòng)物在研究人類疾病模型、異種器官移植和生產(chǎn)生物醫(yī)藥產(chǎn)品方面都顯示出了巨大的研究潛力。但是目前生產(chǎn)的克隆動(dòng)物普遍出現(xiàn)死亡率高，個(gè)體發(fā)育不正常的現(xiàn)象。通過研究發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象與許多細(xì)胞因素有關(guān)，包括：核供體的重編程、卵母細(xì)胞的成熟發(fā)育、X染色體活性和基因表達(dá)、線粒體的變化、細(xì)胞因子的效應(yīng)等。

　　1 核供體重編程和卵母細(xì)胞成熟

　　核移植一大目的就是獲得多產(chǎn)的后代，但是要成功的獲得后代還需要許多事件能夠正常發(fā)生。首先就是核供體需處在一種能夠被重塑，基因組能夠被逐漸的重編程的狀態(tài);其次就是受體卵母細(xì)胞必須成熟，能夠啟動(dòng)重組胚的發(fā)育;再者，就是體外培養(yǎng)體系必須適應(yīng)這種胚胎的生長需求。代孕動(dòng)物的生理狀態(tài)對(duì)核移植后代的成功繁育也有著十分重要的影響，例如，處于排卵前或是排卵后的狀態(tài)，不同的季節(jié)等對(duì)應(yīng)的胚胎的妊娠率和分娩率都有所不同。

　　核移植過程中，目前不僅囊胚發(fā)育率和妊娠率較低，而且產(chǎn)生的后代個(gè)體也多有異常問題而出現(xiàn)新生胎兒出生不久就死亡的現(xiàn)象。主要表現(xiàn)在胎兒個(gè)頭大，心臟肥大、卵圓孔閉合不全、瓣膜發(fā)育不全，肝臟腫大和充血、肝組織發(fā)育不全、脂肪沉積嚴(yán)重，肺不能正常充氣、形態(tài)畸形，脾臟較小、出血，腎臟不成形、伴有大量脂肪沉積，腦組織發(fā)育不全、含量少，等。1-7究其原因，除了上面提到的，估計(jì)得追溯到表觀修飾異常和發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)異常等細(xì)胞內(nèi)深入的活動(dòng)機(jī)制上來。8-10

　　2 X染色體

　　由于劑量補(bǔ)償效應(yīng)，哺乳動(dòng)物的雌性胚胎中的一條X染色體會(huì)發(fā)生失活。Xist基因的表達(dá)決定了這一效應(yīng)的發(fā)生，而且Xist在二細(xì)胞時(shí)期就開始表達(dá)。其表達(dá)還引起了子代細(xì)胞中X染色體復(fù)制不同步，特別是在胚胎致密化之后，這種不同步X復(fù)制的細(xì)胞比例逐漸增加。

　　體外生產(chǎn)的胚胎在培養(yǎng)過程中，雄性胚的生長狀況要優(yōu)于雌性胚，特別是在培養(yǎng)液中含有高濃度的葡萄糖、血清以及相對(duì)較高的溫度都會(huì)給雌性胚的生長帶來不利影響。這種發(fā)育的二態(tài)現(xiàn)象，很可能是由于培養(yǎng)環(huán)境引起了基因的差異表達(dá)。但讓人迷惑的是，有一研究發(fā)現(xiàn)，有384個(gè)基因在正常胚與體外形成胚里表達(dá)有差異，其中85%基因在IVP胚胎中表達(dá)下調(diào);而與X染色體相關(guān)的基因表達(dá)卻上調(diào)11，而且這一情況在雄性胚和雌性胚中相同。Xist與二態(tài)現(xiàn)象之間究竟有什么樣的關(guān)系人需要進(jìn)一步探索。

　　在研究X相關(guān)基因在存活和死亡克隆牛中的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)很多基因出現(xiàn)異常表達(dá)。有意思的是，Xist基因在雄性克隆牛的組織中呈高度甲基化，而在雌性克隆牛組織內(nèi)Xist普遍處于低甲基化水平，而且出生后死亡的克隆牛比圍產(chǎn)期死亡的還要低。這與核重編程不完全有很大的關(guān)系，而且與X染色體選擇性隨機(jī)失活受到干擾有關(guān)。盡管Xist基因的甲基化和Xist的轉(zhuǎn)錄都有是組織差異的，但是Xist基因DNA甲基化程度高的樣品的Xist轉(zhuǎn)錄水平也高，這似乎暗示著還存在其他因素在調(diào)控Xist轉(zhuǎn)錄上起著更大的作用?？傊琗染色體的劑量效應(yīng)及其印記修飾狀況與胚胎的正常發(fā)育有著重要的作用。

　　3 線粒體

　　線粒體在機(jī)體里發(fā)揮重要作用，它不僅給細(xì)胞直接提供能量，而且能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡等生理活動(dòng)。線粒體在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量，形態(tài)和分布狀態(tài)都影響著細(xì)胞的生理功能。線粒體內(nèi)部基因功能不全，其分離、融合等過程都受到核基因的協(xié)作。在成熟的卵母細(xì)胞中線粒體的拷貝數(shù)約為105個(gè)，當(dāng)其受精后，胚胎發(fā)育到囊胚的這段時(shí)期，線粒體都不重新合成，都是使用卵母細(xì)胞遺傳而來的線粒體。近來，研究發(fā)現(xiàn)含有高拷貝線粒體的卵母細(xì)胞其受精率更高，而且對(duì)胚胎發(fā)育更有利。Wai等發(fā)現(xiàn)含有4000個(gè)拷貝的線粒體能夠發(fā)育到胚胎附植前，而要能夠完成完成附植后發(fā)育線粒體的數(shù)量至少要40000-50000個(gè)12。對(duì)附植前的胚胎進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)條件能引起胚胎內(nèi)線粒體過早的開始復(fù)制，線粒體的形態(tài)與定位模式也有所改變。但是目前線粒體影響細(xì)胞功能的詳細(xì)機(jī)理還不太清楚。

　　4 細(xì)胞因子

　　目前，由體細(xì)胞核移植或體外受精生產(chǎn)的胚胎成功發(fā)育為個(gè)體的成率要低于10%。高達(dá)70%的核移植胚胎在妊娠的前三個(gè)月就會(huì)發(fā)生流產(chǎn)。而胎盤發(fā)育異常是這一現(xiàn)象的主要原因，表現(xiàn)為胎盤子葉重量增加，胎盤子葉數(shù)量減少。即使部分胚胎幸運(yùn)地發(fā)育到個(gè)體，不少個(gè)體也會(huì)出現(xiàn)巨大綜合癥。這些克隆帶來的非正?，F(xiàn)象，主要與基因不能按照正常的模式表達(dá)有關(guān)。其中，與細(xì)胞分裂增殖和個(gè)體生長發(fā)育密切相關(guān)的類胰島素生長因子，及其對(duì)應(yīng)的受體和結(jié)合蛋白的正常表達(dá)對(duì)維持胚胎的正常發(fā)育有重要的意義。

　　IGFs有兩種類型，IGF-I和IGF-II。IGF-I既有促進(jìn)生物合成代謝的功能，又有促生長的功能。IGF-II可以介導(dǎo)酶和生物大分子的降解。結(jié)合蛋白除了能運(yùn)輸IGFs幫助其定位外，還能延長其半衰期以及調(diào)節(jié)其活性。它們?cè)谂咛グl(fā)育期的一個(gè)重要的作用就是可以調(diào)節(jié)出生個(gè)體的大小。

　　研究發(fā)現(xiàn)：在25日齡牛胚中，體外受精產(chǎn)生的胚胎表達(dá)的IGF-I的水平要顯著高于正常發(fā)育的胚胎組織;核移植形成的胚胎表達(dá)的IGF-II的水平又要顯著高于體外受精形成的胚胎;核移植產(chǎn)生的胚盤組織中表達(dá)的IGF-II的水平也要顯著高于正常的胚盤13。研究還發(fā)現(xiàn)：看似正常的克隆牛在出生時(shí)血漿中IGF-II的濃度明顯高于人工受精的正常對(duì)照牛，而出生15天后的IGF-II濃度明顯降低; IGF-I在妊娠150天胎兒血漿中的濃度明顯高于IVP的正常對(duì)照;核移植胎盤尿囊液中IGFBP-l的水平也明顯升高14。 　　5 結(jié)語

　　當(dāng)前動(dòng)物克隆技術(shù)作為一項(xiàng)新技術(shù)，由于其巨大的科研價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值而發(fā)展迅速，但是克隆動(dòng)物成活率低成為此項(xiàng)技術(shù)的制約瓶頸，在克隆動(dòng)物技術(shù)中還存在許多科學(xué)問題仍尚待解決?？寺?dòng)物的異常發(fā)育原因可能與細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)的許多因素都相關(guān)，除了上訴提到的因素以外，還有組蛋白的修飾、其他類型的細(xì)胞因子、體外培養(yǎng)條件等方面的因素。時(shí)下較為流行的重編程理論和表觀遺傳學(xué)理論還不能在微觀層面深入對(duì)異常發(fā)育現(xiàn)象作出合理的解釋，新的研究方法和技術(shù)以及新發(fā)現(xiàn)急需出現(xiàn)。

　　參考文獻(xiàn)

　　[1]Arat S， Rzucid lo S J， G ibbons J， et al. Production of transgenic bovine embryos by transfer of transfected granulosa cells in toenucleated oocytes[J].MolRep rod Dev， 2001，60 (1)：20 - 26.

　　[2]Enright B P， Jeong B S， Yang X， et al. Epigenetic characteristics of bovine donor cells for nuclear transfer levels of histone acetylation[J].Biol Reprod，2003，69(5)：1525-1530.

　　[3]Woods G L，White K L， Vanderwall D K， et al.Amule cloned from fetal cells by nu clear transfer[J] . Science，2003，301(5636)：1063.

　　[4]Kishigami S，Mizutani E， OhtaH，et al.Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostat in A after somatic nuclear transfer[J].Biochem Biophys Res Commun， 2006，340(1)：183-189.

　　[5]杜衛(wèi)華，朱化彬，郝海生 等.體細(xì)胞核移植與中心體遺傳[J].遺傳，2008，8：960-966.

　　[6]Simerly C，Navara C，Hyun SH， et al. Embryogenesis and blastocyst development after somatic cellnuclear transfer in nonhuman primates： overcom ing defectscaused by meiotic spindle extraction[J].Dev B iol，2004，276(2)： 237 - 252.

　　[7]楊素芳，石德順，韓杰 等.供體核種類對(duì)水牛核移植效果的影響[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2004，(03)：140-146.

　　8 Yang L，Chavatte Palmer P，Kubota C，et al.Expression of imprinted genes is aberrant in deceased newborn cloned calves and relatively normal in surviving adultclones[J].Mol Rep rod Dev，2005，71(4)：431- 438.

　　9 Beau jean N，Taylor J，G ardner J， et al.Effect of limited DNA methylation reprogramming in the norm al sheep embryo on somatic cell nuclear transfer[J]. BiolReprod， 2004，71(1)：185- 193.

　　10 Wakayam a T，PerryA C， Zuccotti M，et al.Fu ll term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei[J].Nature，1998，394(6691)：369- 374.

點(diǎn)擊下頁還有更多>>>動(dòng)物克隆技術(shù)論文