高中生物選修三基因工程基本操作程序
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高中生物選修三基因工程基本操作程序：
第一步：獲取目的基因
第二步：構(gòu)建基因表達(dá)載體
第三步：將表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞
第四步：目的基因的檢測(cè)與表達(dá)
(1)提取目的基因：獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步.如植物的抗病(抗病毒 抗細(xì)菌)基因,種子的貯藏蛋白的基因,以及人的胰島素基因干擾素基因等,都是目的基因.
要從浩瀚的“基因海洋”中獲得特定的目的基因,是十分不易的.科學(xué)家們經(jīng)過(guò)不懈地探索,想出了許多辦法,其中主要有兩條途徑：一條是從供體細(xì)胞的DNA中直接分離基因;另一條是人工合成基因.
直接分離基因最常用的方法是“鳥(niǎo)槍法”,又叫“散彈射擊法”.鳥(niǎo)槍法的具體做法是：用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段,將這些片段分別載入運(yùn)載體,然后通過(guò)運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞,讓供體細(xì)胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制(在遺傳學(xué)中叫做擴(kuò)增),從中找出含有目的基因的細(xì)胞,再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來(lái).如許多抗蟲(chóng)抗病毒的基因都可以用上述方法獲得.
用鳥(niǎo)槍法獲得目的基因的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便,缺點(diǎn)是工作量大,具有一定的盲目性.又由于真核細(xì)胞的基因含有不表達(dá)的DNA片段,一般使用人工合成的方法.
目前人工合成基因的方法主要有兩條.一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版,反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA,然后在酶的作用下合成雙鏈DNA,從而獲得所需要的基因.另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列,推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列,然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則,推測(cè)出它的基因的核苷酸序列,再通過(guò)化學(xué)方法,以單核苷酸為原料合成目的基因.如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過(guò)人工合成基因的方法獲得.
(2)目的基因與運(yùn)載體結(jié)合：基因表達(dá)載體的構(gòu)建(即目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)是實(shí)施基因工程的第二步,也是基因工程的核心.
將目的基因與運(yùn)載體結(jié)合的過(guò)程,實(shí)際上是不同來(lái)源的DNA重新組合的過(guò)程.如果以質(zhì)粒作為運(yùn)載體,首先要用一定的限制酶切割質(zhì)粒,使質(zhì)粒出現(xiàn)一個(gè)缺口,露出黏性末端.然后用同一種限制酶切斷目的基因,使其產(chǎn)生相同的黏性末端.將切下的目的基因的片段插入質(zhì)粒的切口處,再加入適量DNA連接酶,質(zhì)粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就會(huì)因堿基互補(bǔ)配對(duì)而結(jié)合,形成一個(gè)重組DNA分子.如人的胰島素基因就是通過(guò)這種方法與大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA分子結(jié)合,形成重組DNA分子(也叫重組質(zhì)粒)的.
(3)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞是實(shí)施基因工程的第三步.目的基因的片段與運(yùn)載體在生物體外連接形成重組DNA分子后,下一步是將重組DNA分子引入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增.
基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌,枯草桿菌,土壤農(nóng)桿菌,酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等.
用人工方法使體外重組的DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,主要是借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑.例如,如果運(yùn)載體是質(zhì)粒,受體細(xì)胞是細(xì)菌,一般是將細(xì)菌用氯化鈣處理,以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后,就可以隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制,由于細(xì)菌的繁殖速度非常快,在很短的時(shí)間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因.
(4)目的基因的檢測(cè)和表達(dá)：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后,是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性,只有通過(guò)檢測(cè)與鑒定才能知道.這是基因工程的第四步工作.
以上步驟完成后,在全部的受體細(xì)胞中,真正能夠攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞是很少的.因此,必須通過(guò)一定的手段對(duì)受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因進(jìn)行檢測(cè).檢測(cè)的方法有很多種,例如,大腸桿菌的某種質(zhì)粒具有青霉素抗性基因,當(dāng)這種質(zhì)粒與外源DNA組合在一起形成重組質(zhì)粒,并被轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后,就可以根據(jù)受體細(xì)胞是否具有青霉素抗性來(lái)判斷受體細(xì)胞是否獲得了目的基因.重組DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞后,受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀,才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)過(guò)程.
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