隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,生活水平的提高,人們的消費觀念、健康觀念發(fā)生了較大變化。消費者的自我保健意識日益增強,對保健食品的需求越來越高,這為保健食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了一個重要的契機。我國的保健食品市場是一個存在巨大發(fā)展?jié)摿Φ氖袌?。但是保健食品行業(yè)存在著低水平競爭,重公告輕研發(fā),行業(yè)信譽差等嚴(yán)重的問題。為了保證食品的安全，下面是學(xué)習(xí)啦小編為大家整理的關(guān)于：保健食品標(biāo)識規(guī)定。歡迎閱讀!

　　保健食品標(biāo)識規(guī)定

　　第一條　為了加強對保健食品標(biāo)識和產(chǎn)品說明書的監(jiān)督管理，根據(jù)《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》(以下簡稱《食品衛(wèi)生法》和《保健食品管理辦法》的有關(guān)要求，特制定本規(guī)定。

　　第二條　本規(guī)定適用于在國內(nèi)銷售的一切國產(chǎn)和進口保健食品。

　　第三條　本規(guī)定所用定義如下：

　　保健食品：系指表明具有特定保健功能的食品。即適宜于特定人群食用，具有調(diào)節(jié)機體功能，不以治療疾病為目的食品。

　　功效成分：指保健食品中產(chǎn)生保健作用的組分。

　　食品標(biāo)識：即通常所說的食品標(biāo)簽，包括食品包裝上的文字、圖形、符號以及說明物。借以顯示或說明食品的特征、作用、保存條件與期限、食用人群與食用方法，以及其他有關(guān)信息。

　　最小銷售包裝：指銷售過程中，以最小交貨單元交付給消費者的食品包裝。

　　主要展示版面：指消費者選購商品時，在包裝標(biāo)簽上最容易看到或展示面積最大的表面，一般的食品銷售包裝至少有一個表面可用作主要展示版面。

　　信息版面：是緊接“主要展示版面”右側(cè)的包裝表面。如果因包裝設(shè)計原因，緊接“主要展示版面”右側(cè)的“信息版面”不能滿足標(biāo)簽標(biāo)示的要求(如折疊的包裝袋)時，則“信息版面”可選擇右側(cè)版面右側(cè)的下一個版面。

　　保健食品專用名稱：表明保健食品的主要原料、產(chǎn)品物理形態(tài)、主要加工工藝等食品屬性的名稱。

　　保健食品作用名稱：在保健食品名稱中，用于表明保健食品主要作用的名稱部分。

　　保健作用聲明短語：以短語形式，對保健作用的簡單介紹或描述。

　　第四條　保健食品標(biāo)識與產(chǎn)品說明書的所有標(biāo)識內(nèi)容必須符合下列基本原則：

　　保健食品名稱、保健作用、功效成分、適宜人群和保健食品批準(zhǔn)文號必須與衛(wèi)生部頒發(fā)的《保健食品批準(zhǔn)證書》所載明的內(nèi)容相一致。

　　應(yīng)科學(xué)、通俗易懂，不得利用封建迷信進行保健食品宣傳。

　　應(yīng)與產(chǎn)品的質(zhì)量要求相符，不得以誤導(dǎo)性的文字、圖形、符號描述或暗示某一保健食品或保健食品的某一性質(zhì)與另一產(chǎn)品的相似或相同。

　　不得以虛假、夸張或欺騙性的文字、圖形、符號描述或暗示保健食品的保健作用，也不得描述或暗示保健食品具有治療疾病的功用。

　　第五條　保健食品標(biāo)識與產(chǎn)品說明書的標(biāo)示方式必須符合以下基本原則：

　　保健食品標(biāo)識不得與包裝容器分開、所附的產(chǎn)品說明書應(yīng)置于產(chǎn)品外包裝內(nèi)。

　　各項標(biāo)識內(nèi)容應(yīng)按本辦法的規(guī)定標(biāo)示于相應(yīng)的版面內(nèi)，當(dāng)有一個“信息版面”不夠時，可標(biāo)于第二個“信息版面”。

　　保健食品標(biāo)識和產(chǎn)品說明書的文字、圖形、符號必須清晰、醒目、直觀、易于辨認(rèn)和識讀。背景和底色應(yīng)采用對比色。

　　保健食品標(biāo)識和產(chǎn)品說明書的文字、圖形、符號必須牢固、持久，不得在流通和食品過程中變得模糊甚至脫落。

　　必須以規(guī)范的漢字為主要文字，可以同時使用漢語拼音、少數(shù)民族文字或外文，但必須與漢字內(nèi)容有直接的對應(yīng)關(guān)系，并書寫正確。所使用的漢語拼音或外國文字不得大于相應(yīng)的漢字。

　　計量單位必須采用國家法定的計量單位。

　　第六條　保健食品標(biāo)識與產(chǎn)品說明書必須標(biāo)示本《辦法》附件1所規(guī)定的各項內(nèi)容，其標(biāo)示方式必須符合本《辦法》附件1所規(guī)定的相應(yīng)要求。

　　第七條　凡保健食品標(biāo)識和產(chǎn)品說明書的標(biāo)示內(nèi)容或標(biāo)示方式不符合本《辦法》者，依照《食品衛(wèi)生法》第四十五、四十六條處罰。

　　第八條　本規(guī)定由衛(wèi)生部負(fù)責(zé)解釋。

　　第九條　本規(guī)定自頒布之日起實施。

　　保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法

　　1.主題內(nèi)容和適用范圍

　　本程序和檢驗方法規(guī)定了評價食品保健作用的統(tǒng)一程序和檢驗方法。

　　本程序和檢驗方法適用于評價食品的免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、改善記憶、促進生長發(fā)育、抗疲勞、減肥、耐缺氧、抗輻射、抗突變、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、改善性功能等作用。

　　本程序和檢驗方法規(guī)定了評價食品保健作用的人體試食試驗規(guī)程。

　　2.進行食品保健作用評價的基本要求

　　2.1對受試物的要求

　　2.1.1提供受試物的物理、化學(xué)性質(zhì)(包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、純度、穩(wěn)定性等)等有關(guān)資料。

　　2.1.2受試物必須是規(guī)格化的產(chǎn)品，即符合既定的生產(chǎn)工藝、配方及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.1.3提供受試物安全性毒理學(xué)評價的資料，受試物必須是已經(jīng)過食品安全性毒理學(xué)評價確認(rèn)為安全的物質(zhì)。

　　2.2對實驗動物的要求

　　2.2.1根據(jù)各種試驗的具體要求，合理選擇實驗動物。常用大鼠和小鼠，品系不限，推薦使用近交系動物。

　　2.2.2 動物的性別不限，可根據(jù)試驗需要進行選擇。動物的數(shù)量的要求為小鼠每組至少10只(單一性別)，大鼠每組至少8只(單一性別)。動物的年齡可根據(jù)具體試驗需要而定。

　　2.2.3 動物應(yīng)達到二級實驗動物的要求。

　　2.3 給受試物的劑量及時間

　　2.3.1 各種試驗至少應(yīng)設(shè)3個劑量組，1個對照組，必要時可設(shè)陽性對照組。劑量選擇應(yīng)合理，盡可能找出最低有效劑量。在3個劑量組中，其中一個劑量應(yīng)相當(dāng)于人推薦攝入量的5-10倍左右。

　　2.3.2 給受試物的時間應(yīng)根據(jù)具體試驗而定，原則上至少1個月。

　　3.試驗項目、試驗原則及結(jié)果判定

　　3.1 免疫調(diào)節(jié)作用

　　3.1.1 試驗項目

　　3.1.1.1.1 臟器/體重比值

　　胸腺/體重比值

　　脾臟/體重比值

　　3.1.1.1.2 細(xì)胞免疫功能測定

　　小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗

　　遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

　　3.1.1.1.3 體液免疫功能測定

　　抗體生成細(xì)胞檢測

　　血清溶血素測定

　　3.1.1.1.4 單核-巨噬細(xì)胞功能測定

　　小鼠碳廓清試驗

　　小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗

　　3.1.1.1.5 N細(xì)胞活性測定

　　3.1.1.2 人體試食試驗

　　3.1.1.2.1 細(xì)胞免疫功能測定

　　外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗

　　3.1.1.2.2 體液免疫功能試驗

　　單向免疫擴散法測定IgG、IgA、IgM

　　3.1.1.2.3 非特異性免疫功能測定

　　吞噬與殺菌試驗

　　3.1.1.2.4 N細(xì)胞活性測定

　　3.1.2 試驗原則

　　要求選擇一組能夠全面反映免疫系統(tǒng)各方面功能的試驗，其中細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能三個方面至少各選擇1種試驗，在確保安全的前提下盡可能進行人體試食試驗。

　　3.1.3 結(jié)果判定

　　在一組試驗中，受試物對免疫系統(tǒng)某方面的試驗具有增強作用而對其他試驗無抑制作用，可以判定該受試物具有該方面的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng);對任何一項免疫試驗具有抑制作用可判定該受試物具有免疫抑制效應(yīng)。

　　在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及N細(xì)胞功能檢測中，如有兩個以上(含兩個)功能檢測結(jié)果陽性，即可判定該受試物具有免疫調(diào)節(jié)作用。

　　3.2 延緩衰老作用

　　3.2.1 試驗項目

　　3.2.1.1 動物試驗

　　3.2.1.1.1 生存試驗

　　小鼠生存試驗

　　大鼠生存試驗

　　果蠅生存試驗

　　3.2.1.1.2 過氧化脂質(zhì)含量測定

　　血(或組織)中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量測定

　　組織中脂褐質(zhì)含量測定

　　3.2.1.1.3 抗氧化酶活力測定

　　血(或組織)中超氧化物歧化酶(SOD)活力測定

　　血(或組織)中谷胱甘肽過氧化物酶(GS-PX)活力測定

　　3.2.1.2 人體試食試驗

　　血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量測定

　　血中超氧化物歧化酶(SOD)活力測定

　　血中谷胱甘肽過氧化物酶(GS-PX)活力測定

　　3.2.2 試驗原則

　　衰老機制比較復(fù)雜，迄今尚無一種公認(rèn)的衰老機制學(xué)說，因而無單一、簡便、實用的衰老指標(biāo)可供應(yīng)用，應(yīng)采用盡可能多的試驗方法，以保證試驗結(jié)果的可信性。動物試驗，除上述生存試驗，過氧化脂質(zhì)含量測定、抗氧化酶活力測定3個方面各選一項必做外，可能時應(yīng)多選擇一些指標(biāo)(如腦、肝組織中單胺氧化酶(MAO-B)活力測定等)加以輔助。生存試驗是最直觀、最可靠的實驗方法，果蠅具有生長周期短、繁殖快、飼養(yǎng)簡便等優(yōu)點，通常多選果蠅作生存試驗，但果蠅種系分類地位與人較遠(yuǎn)，故必須輔助過氧化脂質(zhì)含量測定及抗氧化酶活力測定才能判斷是否具有延緩衰老作用。生化指標(biāo)測定應(yīng)選用老齡鼠，除設(shè)老齡對照外，最好同時增設(shè)少齡對照，以比較受試物抗氧化的程度，必要時可將動物試驗與人體試食試驗相結(jié)合綜合評價。

　　3.2.3 結(jié)果判定

　　若大鼠或小鼠生存試驗為陽性，即可判定該受試物具有延緩衰老的作用。

　　若果蠅生存試驗，過氧化脂質(zhì)和抗氧化酶三項指標(biāo)均為陽性，即可判定該受試物具有延緩衰老的作用。

　　若過氧化脂質(zhì)和抗氧化酶兩項為陽性，可判定該受試物具有抗氧化作用，并提示可能具有延緩衰老作用。

　　3.3 改善記憶作用

　　3.3.1 動物試驗

　　跳臺試驗

　　避暗試驗

　　穿梭箱試驗

　　水迷宮試驗

　　3.3.1.2 人體試食試驗

　　韋氏記憶量表

　　臨訂記憶量表

　　3.3.2 試驗原則

　　3.3.2.1 試驗應(yīng)通過訓(xùn)練前、訓(xùn)練后及重測驗前3種不同的給予受試物方法觀察其對記憶全過程(記憶的獲得、記憶鞏固、記憶再現(xiàn))的影響。

　　3.3.2.2 應(yīng)采用一組(2個以上)行為學(xué)試驗方法，以保證實驗結(jié)果的可靠性。

　　3.3.2.3 人體試食試驗為必做項目，并應(yīng)在動物試驗有效的前提下進行。

　　3.3.2.4 除上述試驗項目外，還可以選用嗅覺厭惡試驗、味覺厭惡試驗、操作式條件反射試驗，連續(xù)強化程序試驗、比率程序試驗、間隔程序試驗。

　　3.3.3 結(jié)果判定

　　動物試驗2項或2項以上的指標(biāo)為陽性，且2次或2次以上的重復(fù)測試結(jié)果一致，可以認(rèn)為該受試物具有改善該類動物記憶作用;

　　若人體試食試驗結(jié)果陽性，則可認(rèn)為該受試物具有改善人體記憶作用。

　　3.4 促進生長發(fā)育作用

　　3.4.1 試驗項目

　　3.4.1.1 胎仔情況 活胎數(shù)、?雄比例、死胎數(shù)、分娩胎仔總數(shù)。

　　3.4.1.2 體重及食物利用率 記錄出生時及生后4、7、14、21、30、60d幼鼠的體重，計算斷乳后幼鼠的食物利用率。

　　3.4.1.3 生理發(fā)育指標(biāo) 記錄耳廓分離、門齒萌出、開眼、長毛時間、陰道開放、睪丸下降時間。

　　3.4.1.4 神經(jīng)反射指標(biāo) 平面翻正、前肢抓力、懸崖回避、嗅覺定位、聽覺警戒、負(fù)趨地性、回旋運動、視覺發(fā)育、空中翻正、游泳發(fā)育。

　　3.4.2 試驗原則

　　3.4.2.1 給受試物的時間可根據(jù)具體情況選擇在母鼠孕期或哺乳期至成年期。

　　3.4.2.2 在神經(jīng)反射指標(biāo)中應(yīng)選擇一組(5個以上)的行為學(xué)試驗方法，以保證結(jié)果的可靠性。

　　3.4.3 結(jié)果判定

　　在胎仔情況、體重及食物利用率、生理發(fā)育、神經(jīng)反射4類指標(biāo)中有3類以上(含3類)指標(biāo)為陽性，可認(rèn)為受試物有促進生長發(fā)育的作用。

　　3.5 抗疲勞作用

　　3.5.1 試驗項目

　　負(fù)重游泳試驗

　　爬桿試驗

　　血乳

　　血清尿素氮

　　肝/肌糖原測定

　　3.5.2 試驗原則

　　運動試驗與生化指標(biāo)檢測相結(jié)合。在進行游泳或爬桿試驗前，動物應(yīng)進行初篩。除以上生化指標(biāo)外，還可檢測血糖、乳酸膠氫、血紅蛋白以及磷肌酸等指標(biāo)。

　　3.5.3 結(jié)果判定

　　若1項以上(含1項)運動試驗和2項以上(含2項)生化指標(biāo)為陽性，即可以判斷該受試物具有抗疲勞作用。

　　3.6 減肥作用

　　3.6.1 減肥原則

　　3.6.1.1 減除體現(xiàn)人多余的脂肪，不單純以減輕體重為標(biāo)準(zhǔn)。

　　3.6.1.2 每日營養(yǎng)素的攝入量應(yīng)基本保證機體正常生命活動的要求。

　　3.6.1.3 對機體健康無明顯損害。

　　3.6.2 試驗項目

　　3.6.2.1 動物試驗

　　體重

　　體內(nèi)脂肪重量(睪丸及腎周圍脂肪墊)

　　3.6.2.2 人體試食試驗

　　體重，體重指數(shù)，腰圍，腹圍，臀圍

　　體內(nèi)脂肪含量

　　3.6.3 試驗原則

　　在進行減肥試驗時，除以上指標(biāo)必測外，還應(yīng)進行機體營養(yǎng)狀況檢測，運動耐力測試以及與健康有關(guān)的其它指標(biāo)的觀察。人體試食試驗為必做項目，動物試驗與人體試食試驗相結(jié)合，綜合進行評價。

　　3.6.4 結(jié)果判定

　　在動物試驗中，體重及體內(nèi)脂肪墊2個指標(biāo)均陽性，并且對機體健康無明顯損害，即可初步判定該受試物具有減肥作用。

　　在人體試食試驗中，體內(nèi)脂肪量顯著減少，且對機體健康無明顯損害，可判定該受試物具有減肥作用。

　　3.7 耐缺氧作用

　　3.7.1 試驗項目

　　小鼠常壓耐缺氧實驗

　　3.7.2 結(jié)果判定

　　耐缺氧實驗陽性，說明該受試物具有耐缺氧作用。

　　3.8 抗輻射作用

　　3.8.1 試驗項目

　　3.8.1.1 亞急性試驗

　　30天存活率或平均存活時間

　　白細(xì)胞總數(shù)

　　3.8.1.2 亞慢性或慢性試驗

　　小鼠睪丸染色體畸變試驗

　　小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗

　　3.8.2 試驗原則

　　較高劑量一次輻射，選擇亞急性試驗;小劑量多次輻射，選擇亞慢性或慢性試驗。

　　3.8.3 結(jié)果判定

　　亞急性試驗項目中2項結(jié)果為陽性，則可判定該受試物對較高劑量一次輻射有拮抗作用。

　　亞慢性或慢性試驗中2項結(jié)果為陽性，則可判定該受試物對小劑量多次輻射有拮抗作用。

　　3.9 抗突變作用

　　3.9.1 試驗項目

　　Ames試驗或V79細(xì)胞基因突變試驗

　　小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗

　　小鼠睪丸染色體畸變試驗

　　3.9.2 試驗原則

　　Ames試驗與V79細(xì)胞基因突變試驗任選一項，采用體內(nèi)與體外試驗相結(jié)合的原則。

　　3.9.3 結(jié)果判定

　　抗突變?nèi)椩囼炛杏袃身棡殛栃詴r，則可判定該受試物具有抗突變作用。

　　3.10 抑制腫瘤作用

　　3.10.1 試驗項目

　　動物誘發(fā)性腫瘤試驗

　　動物移植性腫瘤試驗

　　免疫功能試驗

　　N細(xì)胞活性測定

　　單核-巨噬細(xì)胞功能測定

　　3.10.2 試驗原則

　　動物誘發(fā)性腫瘤試驗及動物移植性腫瘤試驗兩項中任選一項，同時必做2項免疫功能試驗

　　3.10.3 結(jié)果判定

　　動物誘發(fā)性腫瘤試驗及動物移植性腫瘤試驗兩項試驗中有一項為陽性，并且對免疫功能無抑作用，則可判定該受試物具有抑制腫瘤的作用。

　　3.11 調(diào)節(jié)血脂作用

　　3.11.1 試驗項目

　　大鼠脂代謝紊亂模型法

　　人體試食試驗

　　3.11.2 試驗原則

　　盡可能動物試驗和人體試食試驗相結(jié)合，綜合進行評價。

　　3.11.3 結(jié)果判定

　　大鼠脂代謝紊亂模型法：結(jié)果為陽性時，可初步判定該受試物具有調(diào)節(jié)血脂作用。

　　人體試食試驗陽性，可判定該受試物對人體具有調(diào)節(jié)血脂作用。

　　3.12 改善性功能作用

　　3.12.1 試驗項目

　　3.12.1.1 交配試驗

　　大鼠交配試驗

　　小鼠交配試驗

　　3.12.1.2 勃起試驗

　　3.12.2 試驗原則

　　評價改善性功能作用，應(yīng)主要觀察是否增強性交功能及陰莖勃起功能。考慮到影響性功能的因素很多，而睪酮對性功能的維持具有重要意義，必要時可對血清睪酮水平進行測定。

　　3.12.3 結(jié)果判定

　　交配試驗(大、小鼠交配試驗任選一項)或勃起試驗中有一項試驗結(jié)果為陽性，即可判定該受試物具有改善性功能的作用。

　　3.13 人體試食試驗規(guī)程

　　4.評價食品保健作用時要考慮的因素

　　4.1 人的可能攝入量除一般人群的攝入量外，還應(yīng)考慮特殊的和敏感的人群(如兒童、孕婦及高攝入量人群)。

　　4.2 人體資料由于存在著動物與人之間的種屬差異、在將動物試驗結(jié)果外推到人時，應(yīng)盡可能收集人群服用受試物的效應(yīng)資料，若體外或體內(nèi)動物試驗未觀察到或不易觀察到食品的保健效應(yīng)或觀察到不同效應(yīng)，而有關(guān)資料提示對人有保健作用時，在保證安全的前提下，應(yīng)進行必要的人體試食試驗。

　　4.3 在將本程序所列試驗的陽性結(jié)果用于評價食品的保健作用時，應(yīng)考慮結(jié)果的重復(fù)性和劑量反應(yīng)關(guān)系，并由此找出其最小有作用劑量。

　　4.4 食品保健作用的檢測及評價應(yīng)由衛(wèi)生部認(rèn)定的保健食品功能學(xué)檢驗機構(gòu)承擔(dān)。

　　附加說明

　　本程序和檢驗方法由衛(wèi)生部衛(wèi)生監(jiān)督司提出。

　　本程序和檢驗方法由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》起草小組負(fù)責(zé)起草。

　　本程序和檢驗方法由衛(wèi)生部委托技術(shù)歸口單位衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所負(fù)責(zé)解釋。

　　進行未列入程序范圍的保健食品功能學(xué)評價時，應(yīng)由保健食品的研制生產(chǎn)者提出檢驗及評價方法，經(jīng)保健食品功能學(xué)檢驗機構(gòu)驗證及衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所組織專家評審，報衛(wèi)生部批準(zhǔn)后方可列入本程序。

　　本程序中無明確判定方法的人體試食試驗結(jié)果，可由負(fù)責(zé)試驗單位組織專家組(至少五人)，按本程序提出的原則要求共同予以評價，并提出判定結(jié)果。

　　免疫調(diào)節(jié)作用檢驗方法

　　動物試驗

　　1.實驗動物

　　選用小鼠。推薦使用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，6-8周齡，18-22g，雌雄均可，數(shù)量為單一性別每組至少10只。

　　2.給受試物的時間、劑量分組

　　經(jīng)口給予受試物15-30d，設(shè)3個劑量組和1個對照組。3個劑量組中，其中1個劑量應(yīng)相當(dāng)于人推薦攝入量的10倍左右。

　　3.實驗方法

　　3.1 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗

　　可任選下列方法之一

　　3.1.1 M法

　　3.1.1.1 原理

　　當(dāng)淋巴細(xì)胞受ConA、PA等致分裂原或特異性抗原刺激后發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞通過線粒體水解　將M(一種淡黃色的唑氮鹽)分解為蘭紫色的甲月替(formazan)結(jié)晶而顯色，其光密度值能夠反映細(xì)胞的增殖情況。

　　3.1.1.2 儀器和材料

　　RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-巰基乙醇(2-ME)、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A(ConA)、鹽酸、異丙醇、M、Hanks液、PBS緩沖液(p7.2-7.4)

　　200目篩網(wǎng)、24孔培養(yǎng)板，96孔培養(yǎng)板(平底)，手術(shù)器械、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測儀、超凈工作臺

　　3.1.1.3 實驗步驟

　　完全培養(yǎng)液 RPMI1640 培養(yǎng)液過濾除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺(200mmol/L)，青霉素(100U/ml)，鏈霉素(100ug/L)及5×10-5mol/L的2-巰基乙醇，用無菌的1mol/L的Cl或1mol/L的NaO調(diào)p至7.0-7.2，即完全培養(yǎng)液。

　　ConA液 用雙蒸水配制成100ug/ml的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱(-20℃)保存。

　　無菌Hanks液 用前以3.5%的無菌NaCO3調(diào)p7.2-7.4。

　　M液 將5mgM溶于1ml p7.2的PBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　酸性異丙醇溶液 96ml 異丙醇中加入4ml 1mo1/L的C1，臨用前配制。

　　3.1.1.3.2 脾細(xì)胞懸液制備

　　無菌取脾，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單個細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hanks液洗3次，每次離心10min (1000r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于2ml的完全培養(yǎng)液中，用臺酚蘭染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/ml。

　　3.1.1.3.3淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

　　將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，一孔加50ul ConA液(相當(dāng)5ug/ml)，另一孔作為對照，置5%CO2，37℃培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入M(5mg/ml)50u1/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝6孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570nm波長測定光密度值。也可將溶解液直接移入1ml比色杯中，在721分光光度計上比色測定，波長570nm。

　　3.1.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

　　一般采用方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力，受試物組的光密度值顯著高于對照組的光密度值，即可判定該項試驗結(jié)果陽性。

　　3.1.2 同位素?fù)饺敕?/p>

　　3.1.2.1 原理

　　淋巴細(xì)胞在有絲分裂原PA、ConA等的刺激下，產(chǎn)生增殖反應(yīng)，DNA和RNA合成明顯增加，如在培養(yǎng)液中加入3-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，則可被轉(zhuǎn)化中的細(xì)胞攝入。測定標(biāo)記淋巴細(xì)胞和放射強度可反映淋巴細(xì)胞增殖的程度。

　　3.1.2.2 儀器和材料

　　RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-巰基乙醇(2-ME)、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A (ConA)、Hanks液 、PBS緩沖液(p7.2-7.4)、3H-TdR、閃爍液[2.5-二苯基噁唑(PPO) 0.5g、1，4-雙-(5-苯基噁唑基)-苯(POPOP)0.25g、二甲苯500ml混勻]

　　200目篩網(wǎng)，96孔培養(yǎng)板(平底)，手術(shù)器械、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、液體閃爍儀、多頭細(xì)胞取集器、49型玻璃纖維濾紙。

　　3.1.2.3 實驗步驟

　　3.1.2.3.1 脾細(xì)胞懸液制備

　　無菌取脾，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hanks液洗3次，每次離心10min(1000r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于2ml的完全培養(yǎng)液中，用臺酚蘭染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)，最后RPMI1640完全培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)成5×105個/ml。

　　3.1.2.3.2 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)：

　　將脾細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，200ul/孔，每一份脾細(xì)胞懸液分裝6個孔，3孔加ConA(5ug/ml)，另3個孔不加ConA作為對照。置5% CO2，37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h，每孔加入3H-TdR 20u1，使其終濃度為(3.7-18.5)×104Bq/ml。用多頭細(xì)胞取集器將細(xì)胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測量瓶中，加入7ml閃爍液，用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。

　　3.1.2.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

　　一般采用方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。以每分鐘脈沖數(shù)(cpm)表示增殖程度，用刺激指數(shù)(SI)來表示試驗孔cpm 。

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