無(wú)菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證
無(wú)菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證
無(wú)菌檢查方法是為了檢查藥典要求無(wú)菌的制劑及其他制品是否無(wú)菌而建立的試驗(yàn)方法！至于無(wú)菌檢查具體有哪些驗(yàn)證方法呢？下面就隨學(xué)習(xí)啦小編一起來(lái)了解下吧！
無(wú)菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證
無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證一般分為前驗(yàn)證和再驗(yàn)證兩種。
前驗(yàn)證，也稱(chēng)預(yù)驗(yàn)證，指在無(wú)菌分析方法正式使用前，按照預(yù)定驗(yàn)證方案進(jìn)行的驗(yàn)證。如果沒(méi)有充分的理由，任何檢查方法必須進(jìn)行前驗(yàn)證。
再驗(yàn)證，指某一檢查方法經(jīng)過(guò)驗(yàn)證并在使用一段時(shí)間后進(jìn)行的，旨在證實(shí)已驗(yàn)證狀態(tài)沒(méi)有發(fā)生飄移而進(jìn)行的重新驗(yàn)證及對(duì)檢查方法進(jìn)行修訂、改變時(shí)進(jìn)行的驗(yàn)證。
通常一個(gè)無(wú)菌產(chǎn)品的檢查流程為：首先基于產(chǎn)品的劑型、溶解度等性質(zhì)，按照藥典的要求確定是否需要進(jìn)行前處理;然后根據(jù)產(chǎn)品的特性是否有抑菌性，確定是否需要增加去除產(chǎn)品抑菌性的方法;最后驗(yàn)證整個(gè)檢查方法中用到的一切及試驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)包括樣品的預(yù)處理方式、檢查過(guò)程、培養(yǎng)條件等均不影響樣品中微生物的生長(zhǎng)。
前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)是驗(yàn)證的重點(diǎn)。
供試品中抑菌活性的去除是當(dāng)前驗(yàn)證工作的重點(diǎn)，尤其強(qiáng)調(diào)應(yīng)充分驗(yàn)證供試品本身對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響。
(一)具體的驗(yàn)證方法如下：
1. 菌種的選擇
無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證中通常選擇以下6種試驗(yàn)中常用的控制菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，它們分別代表不同類(lèi)型的菌種：枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63 501]代表藥品中常見(jiàn)的污染菌——芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26 003]代表革蘭陽(yáng)性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厭氧菌、大腸埃希菌 [CMCC(B)44 102]代表革蘭陰性菌、白色念珠菌 [CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。
2. 菌液的制備
接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30~35 ℃培養(yǎng)18~24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，23~28℃培養(yǎng)24~48h，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23~28 ℃培養(yǎng)5~7天，加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。
3. 樣品的前處理
無(wú)菌產(chǎn)品中每個(gè)成分應(yīng)該是均勻的，因此只要確定在驗(yàn)證的方法中，按所需的總接種量即可，而不必像樣品日常檢測(cè)中按規(guī)定的容器數(shù)取樣。
如果制備樣品時(shí)需要使用溶解劑、稀釋劑、助溶劑、破乳劑等溶劑，需要確保這些溶劑是有效的，并且其使用對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)影響;或者制備過(guò)程中需要對(duì)樣品進(jìn)行加熱助溶、離心等操作時(shí)，需要確保加熱的溫度、離心速度和離心時(shí)間等對(duì)微生物生長(zhǎng)或分布無(wú)影響。 不需前處理的樣品免做。
(二)消除樣品抑菌性的方法
無(wú)抑菌性樣品的驗(yàn)證方法：依據(jù)產(chǎn)品溶解性和微生物限度選擇合適的中性稀釋劑溶解和稀釋?zhuān)弥苯咏臃N法驗(yàn)證，常用中性稀釋液或淋洗液。
對(duì)于具有抑菌性樣品的驗(yàn)證方法，首先確定樣品的抑菌作用(抑細(xì)菌、真菌試驗(yàn)驗(yàn)證)，選擇敏感標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)供試品抑菌活性去除效果檢查(陽(yáng)性菌回收試驗(yàn))。 常用的消除樣品抑菌活性的方法如下：
1. 稀釋法：利用降低供試品的相對(duì)濃度，將樣品稀釋至最低抑菌濃度下進(jìn)行。如：取規(guī)定量的樣品溶液至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的樣品含量減少，至不含抑菌作用。
2. 薄膜過(guò)濾法：利用體積差異分離，通過(guò)薄膜過(guò)濾，微生物被截于濾膜，培養(yǎng)薄膜觀察有無(wú)微生物生長(zhǎng)。通常薄膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑一般為50?mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。濾器和濾膜在使用前采用適宜的方法進(jìn)行滅菌。使用時(shí)應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類(lèi)供試液其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。 供試液經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100?ml?？倹_洗量不得超過(guò)1000ml。
3. 化學(xué)中和法：利用化學(xué)(生物)專(zhuān)屬性滅活，常用中和劑或滅活方法有：對(duì)氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。對(duì)化學(xué)中和劑不敏感的樣品，用酶中和，如β -內(nèi)酰胺酶。
4. 聯(lián)合使用：將以上兩種或幾種方法組合運(yùn)用，以消除樣品的抑菌性。適用于抑菌作用較強(qiáng)的中西藥制劑。
5. 其次按照以下要求制備3組樣品：
樣品組：選擇以上適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ泻蜆悠?，加入少量?yàn)證微生物(接種量少于100cfu)。
對(duì)照組：0.1%蛋白胨或pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,加少量微生物(接種量少于100cfu)。
陽(yáng)性對(duì)照組：將試驗(yàn)菌株直接接種于培養(yǎng)基中(接種量少于100cfu)。
6. 最后結(jié)果分析如下：
樣品組與對(duì)照組微生物生長(zhǎng)數(shù)量相似，表明中和劑的中和方式有效消除了樣品的抑菌性(即有效性)，如果對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組的微生物數(shù)量相似，表明樣品預(yù)處理、消除樣品抑菌性的方法、檢測(cè)程序和培養(yǎng)條件等均不影響微生物生長(zhǎng)(即無(wú)毒性)。樣品如無(wú)抑菌性，省去對(duì)照組試驗(yàn)，樣品組與陽(yáng)性對(duì)照組直接比較。樣品組微生物生長(zhǎng)數(shù)量不及陽(yáng)性對(duì)照組微生物生長(zhǎng)數(shù)量，表明樣品的預(yù)處理、試驗(yàn)用器具材料、培養(yǎng)條件等方面存在對(duì)微生物生長(zhǎng)不利的因素。
(三) 為考查驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗(yàn)證至少需3個(gè)不同批次的同類(lèi)樣品，分別進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。
無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)
薄膜過(guò)濾法：按照藥典的要求取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的樣品總量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾、沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾桶內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按照藥典的要求的溫度和時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。
直接接種法：取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100?cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對(duì)照，按照藥典的要求的溫度和時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。
結(jié)果判斷
同對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則說(shuō)明驗(yàn)證通過(guò);如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，驗(yàn)證失敗，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑和滅活劑、更換濾膜等方法，消除供試品的抑菌作用，重新進(jìn)行驗(yàn)證。
無(wú)菌檢查的常見(jiàn)方法
首先要檢查方法驗(yàn)證方案設(shè)計(jì)的科學(xué)性和完整性，是否有與藥典方法相悖的地方，尤其是產(chǎn)品本身的抑菌性，檢查方法的選擇，是直接接種法還是薄膜過(guò)濾法等。
無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證的硬件是否具備及是否已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)的確認(rèn)。如使用黑曲霉菌是否具有生物安全柜并進(jìn)行確認(rèn)，無(wú)菌室的確認(rèn)及日常監(jiān)測(cè)，培養(yǎng)箱的型號(hào)及數(shù)量和進(jìn)行確認(rèn)的情況等，智能集菌器、全封閉無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)濾培養(yǎng)器的型號(hào)、性能，濾膜是否符合規(guī)定等。
驗(yàn)證中各個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)數(shù)據(jù)的真實(shí)性，如產(chǎn)品本身抑菌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，菌種回收率和培養(yǎng)基適用性和靈敏度檢查數(shù)據(jù)，菌種的傳代、銷(xiāo)毀和使用記錄，無(wú)菌檢查操作記錄、培養(yǎng)記錄等。
無(wú)菌檢查中偏差的處理是否真的找到了根本原因，是否在沒(méi)有確切的原因前就對(duì)樣品重新檢查并依據(jù)新的檢查結(jié)果放行產(chǎn)品。
驗(yàn)證的方法與無(wú)菌檢查操作規(guī)程和無(wú)菌檢查記錄是否完全一致，如操作步驟、檢查方法、檢查環(huán)境、試驗(yàn)耗材均需與實(shí)際檢查操作規(guī)程及驗(yàn)證過(guò)程完全相符。
為了考查驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗(yàn)證時(shí)是否至少采用了3個(gè)不同批次的同類(lèi)樣品，分別進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)。
使用新的濾膜或過(guò)濾器(不同廠家或批號(hào)、型號(hào))是否重新進(jìn)行樣品試驗(yàn)組、蛋白胨對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的驗(yàn)證確認(rèn)。
除非樣品不能采用過(guò)濾的方法(難溶解)，企業(yè)是否采用全封閉的薄膜過(guò)濾法。
菌液的保存條件和保存期限是否符合藥典的要求，對(duì)于黑曲霉孢子懸液是否有驗(yàn)證的資料。
無(wú)菌檢查的注意事項(xiàng)
培養(yǎng)基的適用性檢查包括培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查和培養(yǎng)基的靈敏度檢查。
中國(guó)藥典附錄中規(guī)定的檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽(yáng)性對(duì)照用樣品量，雖然附錄另處有專(zhuān)門(mén)說(shuō)明，仍然容易忽略。
無(wú)菌檢查時(shí)應(yīng)強(qiáng)調(diào)“檢驗(yàn)數(shù)量”，主要是保證試驗(yàn)結(jié)果的代表性，而陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)和驗(yàn)證時(shí)僅須滿(mǎn)足“檢驗(yàn)量”總量要求即可，以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，驗(yàn)證試驗(yàn)可以由此減少大量的樣品;工作菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代，以防止過(guò)度的傳代增加菌種變異的風(fēng)險(xiǎn)。這里“代”的定義是指，活的培養(yǎng)物接種到微生物生長(zhǎng)的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，任何亞培養(yǎng)的形式均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代一次。
菌液加入，按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽(yáng)性菌液，主要是考慮過(guò)濾器的有效性。過(guò)濾器的有效性應(yīng)由提供企業(yè)控制，用戶(hù)可采用適當(dāng)方法抽查(如檢查陽(yáng)性菌液通過(guò)濾筒的流出液)。
實(shí)驗(yàn)室菌種的處理和保存的程序應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，以盡可能減少菌種污染和變異。
試驗(yàn)時(shí)菌懸液并不是只要活的菌體就行，而是要保持旺盛的生命力，所以菌懸液存放時(shí)間不能太長(zhǎng)。
菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2?h內(nèi)使用，若保存在2～8℃，可在24?h內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。
薄膜過(guò)濾法采用大樣品量集菌的方法，具有代表性，不易漏檢，儀器操作相對(duì)簡(jiǎn)單。該系統(tǒng)是全封閉過(guò)濾系統(tǒng)，避免了操作過(guò)程中外源性微生物的污染，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的可信性影響較小。因此無(wú)菌試驗(yàn)采用薄膜過(guò)濾法還是直接接種法并不依賴(lài)于驗(yàn)證結(jié)果，而是取決于樣品的特性，如能采用過(guò)濾的方法均應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法檢查。
若樣品含有抑菌成分，當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，應(yīng)先將供試液稀釋后在過(guò)濾，這樣可以減少濾膜對(duì)樣品的吸附，減少?zèng)_洗量，進(jìn)而減少微生物的損失或傷害。
無(wú)菌檢查應(yīng)作為穩(wěn)定性考察的項(xiàng)目進(jìn)行，以便對(duì)產(chǎn)品有效期的制定和合理的確定儲(chǔ)存條件提供重要的依據(jù)。
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