細胞與克隆技術(shù)論文(2)
細胞與克隆技術(shù)論文二：重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的制備
作者：張琦，盧改娜，謝旦立，甄偉春，樓永良
【摘要】 目的：制備重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(recombinant Vibrio vulnificus cytolysin，rVVC)鼠源性單克隆抗體，并對其特異性及免疫球蛋白類型進行鑒定，為創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vibrio vulnificus cytolysin，VVC)致病機制的后續(xù)研究及創(chuàng)傷弧菌引起的食品污染中溶細胞毒素快速檢測試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法：IPTG誘導含pET28a(+)-vvhA的大腸桿菌表達rVVC，將rVVC純化、復性后經(jīng)甲醛脫毒作為抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE檢測蛋白純化后效果。采用雜交瘤技術(shù)和ELISA法制備并篩選分泌rVVC單克隆抗體的雜交瘤細胞株，有限稀釋法對陽性孔克隆化培養(yǎng)。采用免疫雙擴法鑒定單克隆抗體類型，ELISA法、免疫雙擴法鑒定單克隆抗體的特異性。結(jié)果：將純化復性后的rVVC作為抗原免疫小鼠后，經(jīng)ELISA檢測，血清有效稀釋度達1:12800。共獲得2株可持續(xù)分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別為B2C7和E3F4株，其抗體類型均為IgG1，且具有較高特異性，與多種其他細菌蛋白不發(fā)生免疫反應(yīng)。結(jié)論：本研究成功免疫BALB/c小鼠，獲得B2C7和E3F4兩株可持續(xù)穩(wěn)定分泌rVVC鼠源性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，抗體類型為IgG1型。
【關(guān)鍵詞】 創(chuàng)傷弧菌;溶細胞素;vvhA基因;雜交瘤;單克隆抗體
Abstract: Objective: Mouse-original monoclonal antibody against recombinant Vibrio vulnificus cytolysin (rVVC) was prepared and its specificity and type of immunoglobulin were identified，which can lay a foundation for the further study of Vibrio vulnificus cytolysin (VVC) pathogenesis and the development of rapid detection kit of Vibrio vulnificus cytolysin. Methods:IPTG was used to induce E.coli BL21 (DE3)pET28a(+)-vvhA to express rVVC. The rVVC which purificated，refolded and then detoxi-fied was used to immune BALB/c. The effects of expression and purification of rVVC were determined by SDS-PAGE. The hybridoma cell lines to secrete anti-rVVC monoclonal antibodies were prepared and screened by hybridoma technique and ELISA，and then were cloned with limited dilution. Double immunodiffusion assay was used to identify the type and subclass of monoclonal antibody. ELISA and double immunodiffusion assay were used to determine the specificity. Results:The mice immunized by rVVC which had been purified，refolded and detoxified showed the highest serum dilution to 1:12800 by ELISA. Two cell lines of hybridoma were screened out，and cells of B2C7 and E3F4 were found to be continuously secreting IgG1 monoclonal antibodies. The monoclonal antibodies showed high specificity，and didn’t react with the proteins from other bacteria. Conclusion:BALB/c mice is successfully immunized and two mouse-origin hybridoma cell lines named B2C7 and E3F4 which continually and steadily secreted specific monoclonal antibodies against rVVC are acquired. The type of monoclonal antibody against rVVC is IgG1.
Key words: Vibrio vulnificus;cytolysin;vvhA gene;hybridoma;monoclonal antibody
創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)是一種有莢膜的革蘭陰性嗜鹽弧菌，主要存在于海水及海產(chǎn)品中，可引起原發(fā)性敗血癥和嚴重的創(chuàng)口感染[1-2]。近幾年，浙江沿海、深圳也時有報道該菌感染病例，已引起很多專家學者關(guān)注。創(chuàng)傷弧菌可能包含諸多毒力因子[3]，溶細胞素是其唯一分泌至胞外具有種特異性的膜成孔類外毒素[4]，可作用于多種靶細胞誘導細胞凋亡、壞死，引起細胞炎癥反應(yīng)等[5-6]。此外，體外重組的創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(recombinant Vibrio vulnificus cytolysin，rVVC)亦具有典型的細胞毒活性，能引起人ECV304細胞凋亡[7]，誘導人SMMC7721細胞產(chǎn)生細胞應(yīng)激，上調(diào)其TNF-α和HSP90的表達[8]。目前，有關(guān)創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vibrio vulnificus cytolysin，VVC)抗體的研究較少，姚蔚等[9]曾利用體外rVVC制備了其多克隆抗體，并證實該多抗能阻斷rVVC對SMMC7721的細胞毒作用，為保護性抗體。而單克隆抗體相比多克隆抗體，具有更高的特異性。因此，本研究中，我們采用Ni2+-NTA親和層析法純化原核表達的rVVC，采用雜交瘤技術(shù)制備鼠源性rVVC單克隆抗體并進行免疫學鑒定，以期為VVC致病機制的深入研究及創(chuàng)傷弧菌引起的食品污染中溶細胞毒素的快速檢測試劑盒研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1細胞系、菌種及質(zhì)粒：小鼠骨髓瘤SP2/ 0細胞系購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。E.coli BL21(DE3)pET28a(+)-vvhA由本實驗室構(gòu)建完成及保存。
1.1.2實驗動物：清潔級雌性6周齡BALB/c小鼠購自中科院上海實驗動物中心(上海斯萊克實驗動物有限公司)，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。
1.1.3主要試劑：Ni2+-NTA親和層析樹脂購自上海申能博彩生物科技有限公司。異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)購自寶生物工程(大連)有限公司。還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSH)、鹽酸胍及精氨酸購自BBI公司。HRP標記羊抗小鼠IgG、TMB底物顯色液購自天根生化科技(北京)有限公司。優(yōu)級胎牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司。RPMI 1640購自Hyclone公司。PEG6000、HT和HAT培養(yǎng)基購自SIGMA公司。PEG2000購自上海生工。
1.2方法
1.2.1rVVC的表達、純化及復性：將pET28a(+)-vvhA-E.coli接種于含有卡那霉素(終濃度為25～30μg/mL)的固體培養(yǎng)基中37 ℃孵育，挑取生長菌落至含有卡那霉素(同上)的LB液體培養(yǎng)基37 ℃搖床培養(yǎng)。測菌體濃度，當OD值為0.6～1.0時，加0.5 mmol/L IPTG誘導表達rVVC，振蕩培養(yǎng)4 h。11000 r/min離心收集菌體，加入PBS和少量溶菌酶重懸進行超聲破碎，11000 r/min離心收集沉淀。沉淀用洗滌液I(2 mol/L尿素、10% Triton-100、20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)、洗滌液II(20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)、洗滌液III(去離子水)分別洗4、3、2次，12000 r/min離心棄上清。用SDS-PAGE檢測洗滌效果。將洗滌后的包涵體用復溶液(8 mol/L尿素、1% β-巰基乙醇、100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0)充分溶解，12000 r/min離心取上清進行Ni2+-NTA親合層析純化。將層析后的收集液放入透析袋中透析，并將透析后的各組分進行SDS-PAGE檢測純化效果。用Broadford法對上述蛋白進行定量后，用550 mmol/L 鹽酸胍充分裂解包涵體后，采用李桂軍等[10]報道的方法，將復性液緩慢加入到已充分裂解的包涵體中，用復性液(55 mmol/L Tris-HCl、10.56 mmol/L NaCl、0.44 mmol/L KCl、0.55% PEG6000、550 mmol/L鹽酸胍、1.1 mmol/L EDTA、440 mmol/L蔗糖、550 mmol/L精氨酸、1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSH)進行稀釋復性后再經(jīng)4 ℃三步透析復性。復性后蛋白溶液12000 r/min離心，上清冷凍干燥至干粉，-70 ℃保存。
1.2.2免疫BALB/c小鼠和ELISA法檢測：純化復性后rVVC抗原用0.3%～0.4%的甲醛脫毒，4 ℃過夜。初次免疫rVVC與完全弗氏佐劑等量混合乳化，皮下多點注射;20 d后第2次免疫，與弗氏不完全佐劑等量混合乳化，皮下多點注射;之后每隔10 d免疫一次，均與弗氏不完全佐劑等量混合乳化，皮下多點注射。期間斷尾采血，ELISA法檢測免疫血清效價。達到效果后于融合前3 d腹腔注射不含佐劑的rVVC抗原加強免疫。每次免疫抗原量為10μg。ELISA法測定時，用10μg/mL rVVC包被酶標板，4 ℃過夜。用含0.05% Tween-20的洗滌液洗板后，加入倍比稀釋的免疫前與免疫后的小鼠血清(1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，1∶25600)，37 ℃孵育1 h，洗板(同上)。加入1∶500稀釋的HRP標記羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h，洗板(同上)。加底物顯色液(TMB)作用20 min左右，用1 mol/L的H2SO4終止其反應(yīng)，酶標儀(Thermo)測定[11]。
1.2.3SP2/0細胞培養(yǎng)：SP2/0細胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo 3111)中培養(yǎng)。視細胞生長情況進行換液、傳代或凍存。融合前SP2/0細胞用含有8-氮雜鳥嘌呤(20μg/mL)、20% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)1周。
1.2.4細胞融合和雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)：頸椎脫臼處死BALB/c小鼠，無菌取脾，注射器法制備脾細胞懸液。脾細胞懸液經(jīng)1000 r/min 離心5 min后，棄上清。沉淀中加入3 mL 4 ℃預(yù)冷的Tris-NH4Cl冰浴5 min使脾細胞中混有的紅細胞破裂，加入7 mL RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止其作用，1000 r/min離心5 min棄上清，沉淀用5 mL RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，計數(shù)。處于對數(shù)期的SP2/0計數(shù)后，調(diào)整SP2/0與脾細胞的比例，以1:10進行混合，利用37 ℃預(yù)熱的50% PEG2000，pH 8.0促進其融合。融合后細胞接種于已鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合當天用HAT培養(yǎng)液選擇性培養(yǎng)，5 d后觀察細胞，視細胞生長狀況HAT半換液。2周后換HT培養(yǎng)液培養(yǎng)1周，然后換成20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，以后隔天半量換液1次。最后用10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)。待雜交瘤細胞集落長至1/3每孔時，取細胞上清液用ELISA法檢測抗體，對其進行初篩，并對陽性克隆孔及時凍存和克隆化培養(yǎng)[12]。
1.2.5陽性雜交瘤細胞的克隆化及凍存：對陽性克隆孔細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度，用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化[13]培養(yǎng)，每孔細胞數(shù)約為0.8個。以SP2/0細胞上清液為陰性對照，間接ELISA法檢測孔內(nèi)細胞上清液。陽性孔重復以上步驟克隆化培養(yǎng)3次?？贵w陽性細胞株連續(xù)培養(yǎng)期間用ELISA進行檢測，并對每次克隆化的陽性克隆孔及時凍存。需凍存細胞用預(yù)冷凍存液重懸計數(shù)調(diào)整細胞密度為2～5×106/mL。分裝至凍存管，2 mL/管，做好標記。先置于4℃ 40 min，-20 ℃ 1 h，-70 ℃過夜，最后轉(zhuǎn)至-196 ℃液氮罐保存。
1.2.6單克隆抗體免疫球蛋白類型鑒定：取2 mL陽性單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液裝入透析袋中，利用PEG6000，4 ℃包埋濃縮至0.2 mL(濃縮10倍)時轉(zhuǎn)至小管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。雙向免疫擴散法鑒定分泌的rVVC單克隆抗體類型。中間一孔加10μg/mL的二抗(羊抗鼠IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM)，周邊加PEG6000濃縮后的上清液，10μL/孔。
1.2.7單克隆抗體特異性鑒定：將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌超聲破碎制備抗原，用包被緩沖液(0.05 mol/L碳酸緩沖液pH 9.6)調(diào)節(jié)其濃度為50μg/mL，rVVC濃度為5μg/mL，包被酶標板。間接ELISA法測定陽性雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的單克隆抗體特異性;同時用雙向瓊脂擴散法鑒定其特異性，方法1.2.6。中間一孔為抗原(上述五種抗原)，周邊孔為濃縮后細胞上清液。
1.2.8細胞復蘇及抗體分泌穩(wěn)定性測定：從液氮罐中快速取出凍存管，37 ℃水浴速融，加入10 mL預(yù)冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1000 r/min離心棄上清。加入含10% FBS的RPMI 1640，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天時細胞換液繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3個月。期間每半月用間接ELISA檢測雜交瘤細胞分泌狀況。
2結(jié)果
2.1rVVC表達及純化效果經(jīng)IPTG誘導的pET28a(+)-vvhA大腸桿菌成功表達rVVC，產(chǎn)量約為細菌總蛋白的35%。菌體經(jīng)超聲破碎后離心，沉淀經(jīng)洗滌液I、II、III洗滌后可得到較純蛋白(見圖1)，再經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化后由Bandscan V5軟件分析蛋白純度，圖2中標注8的泳道，目的蛋白純度可達93%(見圖2)。
2.2小鼠免疫結(jié)果重組溶細胞素包被濃度為10μg/mL，免疫后小鼠血清和免疫前陰性對照血清按1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600濃度稀釋。結(jié)果判定，S/N值>2.1均為陽性。ELISA法檢測結(jié)果(見圖3)顯示，血清有效稀釋度為1:12800。
2.3雜交瘤細胞系的選擇性培養(yǎng)結(jié)果免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合后，經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇性篩選，融合率為31.11%，抗體陽性率為26.20%。經(jīng)3次亞克隆，ELISA法篩選，得到2株穩(wěn)定分泌rVVC單克隆抗體的雜交瘤細胞株B2C7與E3F4。圖4為不同時間融合細胞生長情況。
2.4單克隆抗體免疫球蛋白類別及亞型鑒定根據(jù)圖5可知，B2C7和E3F4雜交瘤細胞株分泌的rVVC單克隆抗體類型均為IgG1。未見與其他類和亞類的交叉反應(yīng)，由此可見獲得的雜交瘤細胞為具有分泌單一抗體能力的單一細胞系來源的雜交瘤細胞。
2.5單克隆抗體特異性檢測由間接ELISA法檢測(見表1)得出E3F4和B2C7兩細胞株分泌的單克隆抗體與rVVC抗原結(jié)合較強，幾乎不與其他抗原反應(yīng)，E3F4株細胞分泌的抗體特異性最強。雙向瓊脂擴散法檢測發(fā)現(xiàn)，rVVC與細胞上清抗體之間有明顯沉淀線，而與其他抗原無明顯的反應(yīng)(見圖6)。
2.6單克隆抗體分泌穩(wěn)定性檢測由圖7可知，獲得的2株細胞，在復蘇后的90 d經(jīng)EILSA法檢測細胞培養(yǎng)液上清，抗體效價波動幅度不大，具有較穩(wěn)定的分泌抗體的能力。
3討論
創(chuàng)傷弧菌是一種致病性極強的嗜鹽性細菌，人一旦感染，短時間內(nèi)就會引起傷口炎癥，嚴重時會導致敗血癥的發(fā)生。創(chuàng)傷弧菌溶細胞素是其主要毒力因子之一，經(jīng)VVC注射的實驗鼠可出現(xiàn)與創(chuàng)傷弧菌敗血癥病人類似的臨床和病理表現(xiàn)，毫克級水平即可對實驗鼠致死。我們利用IPTG誘導pET28a(+)-vvhA的大腸桿菌表達rVVC，經(jīng)純化及復性后成功獲得有活性的rVVC。在對表達后沉淀(包涵體)進行洗滌時發(fā)現(xiàn)，洗滌液(尤其是洗滌液I)洗滌包涵體對蛋白純化非常重要，可提高Ni2+-NTA親和層析對rVVC提純效果。純化后蛋白經(jīng)復性后將正確的抗原表位表露出來，使制備的rVVC單克隆抗體能識別溶細胞素的抗原表位。經(jīng)表達、純化及復性后得到的rVVC對溶細胞素單克隆抗體制備、致病機制及免疫性研究提供了有利條件。利用基因工程獲得rVVC蛋白方法簡便，且高效，獲得的rVVC的毒性與自然表達的溶細胞素相比毒性較低，再經(jīng)甲醛脫毒后可在此基礎(chǔ)上消除毒性，但保留其免疫原性，可相對增加每次的免疫劑量，從而提高免疫成功率。
脫毒后重組溶細胞素抗原與弗氏佐劑等體積混合乳化，佐劑可以減慢抗原的降解，使抗原在免疫部位緩慢、持久釋放，從而提高巨噬細胞對抗原的攝取效率，促進抗體的產(chǎn)生，提高免疫效率。誘導免疫小鼠對抗原產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，亦即融合所需B細胞群中必須含有能分泌研究所需的特異性抗體的B細胞，而且數(shù)量越多、比例越高越好。一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細胞產(chǎn)生高效價特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量(如抗體的濃度與親和力)也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關(guān)。
本實驗成功獲得rVVC抗體陽性的雜交瘤細胞株B2C7和E3F4株，其可持續(xù)穩(wěn)定分泌rVVC單克隆抗體。B2C7和E3F4株單克隆抗體均為IgG1類，這將有利于標記二抗的選擇及建立相應(yīng)的免疫檢測方法。ELISA法檢測結(jié)果證實，B2C7和E3F4單克隆抗體有較高的特異性，與多種細菌超聲破碎抗原無反應(yīng)。本實驗結(jié)果為進一步深入研究VVC的致病機制及研發(fā)針對創(chuàng)傷弧菌引起的食品污染中溶細胞毒素快速檢測的試劑盒具有重要意義。
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